Клональное микроразмножение – это разновидность вегетативного размножения, осуществляемого в культуре in vitro. В настоящее время большое число видов растений выращивается in vitro по следующим соображениям:
- для поддержания и размножения небольшого числа ценных геноти-пов;
- для ускоренного размножения новых ценных сортов плодовых и декоративных культур;
- для получения большого количества оздоровленного посадочного материала;
- для быстрого размножения некоторых гетерозиготных садовых форм, обычно размножаемых семенами;
- для получения из клонированных родительских форм семян гибридов F1.
Клональное микроразмножение включает в себя следующие эта-пы:
1) введение в культуру in vitro;
2) пролиферация побегов или собственно микроразмножение;
3) укоренение и акклиматизация побегов in vivo.
Ход работы. С маточных растений заготавливаются активно растущие побеги длиной 5 – 10 см и переносятся в лабораторию. Все листья удаляются. Для стерилизации используется 3 – 9 %-ный (в зависимости от чистоты материала) раствор гипохлорита кальция. Для лучшего смачивания тканей экспланта стерилизующим раствором следует использовать детергент Твин-20 (1капля на каждые 50 мл).
В 200 – 250 мл стерилизующего раствора помещаются экспланты и перемешиваются на магнитной мешалке в течение 20 – 30 минут. В условиях ламинар-бокса экспланты отмываются в стерильной воде 3 – 4 раза для удаления остатков антисептика. С помощью пинцета экспланты по 2 – 5 шт. помещаются на стерильные бумажные "матрасики", после чего с помощью скальпеля удаляются 0,5 – 1,0 см поврежденной ткани. Побеги разрезаются на экспланты длиной 2 – 4 см и помещаются на питательную среду. Для культивирования на первом этапе микроразмножения используются только пробирки, поскольку в этом случае удается избежать перезаражения эксплантов. Культивирование эксплантов осуществляется в культуральной комнате при длине дня 16 часов, освещенности 1 – 6000 люкс, температуре 25 – 270С в течение 3 – 4 недель. После окончания культивирования инфицированные экспланты удаляются, оставшиеся используются для переноса на второй этап. Как правило, после прохождения первого этапа из пазушных почек и непосредственно из каллуса, который часто образуется в нижней части экспланта, формируются пазушные и придаточные (адвентивные) побеги, которые используются как экспланты для переноса на второй этап. Культивирование на втором этапе осуществляется в банках или колбах объемом 300 – 500 мл. В течение культивирования на втором этапе (6 – 8 недель) экспланты формируют новые побеги, которые, в свою очередь, могут быть использованы для размножения (пересадка на второй или последующие пассажи) или для укоренения.
Укоренение микропобегов осуществляется на питательной среде с ауксинами. Для укоренения используются микропобеги длиной 2 см и более, которые помещаются вертикально на агаризованную питательную среду. В течение 3 – 4 недель в нижней части микропобегов формируется каллус, из которого образуются первичные корешки. Акклиматизация микрорастений осуществляется в смеси торфа (рН 5.5 – 6.0) с песком или перлитом в соотношении 3:1 с использованием туманообразующей установки или в теплице. В случае появления очагов инфекции на растениях или субстрате следует произвести обработку раствором фунгицида. После прохождения периода акклиматизации и укоренения in vivo (3 – 4 недели) микрорастения пикируются в горшки с субстратом и доращиваются в пленочной теплице до реализации или высадки в открытый грунт.
В отдельных случаях укоренение микропобегов может осуществляться в не стерильных условиях. В качестве вещества, индуцирующего ризогенез, используется ростовая пудра на основе ИУК или ИМК. Микропобеги размером 2 см и более отделяются друг от друга и помещаются в емкость с водой для предотвращения подсыхания. Затем нижний конец каждого обрабатывается ростовой пудрой и побеги помещаются в субстрат для укоренения. Укоренение происходит через 2-3 недели, если температура поддерживается в пределах 25 – 27о, освещенность – 2000 – 3000 люкс, а поверхность листочков постоянно смачивается водой. Через 8-10 недель после постановки на укоренение микрорастения готовы для пикировки.