Аффинная хроматография



Метод основан на способности белков прочно связываться с различными молекулами нековалентными связями. Используется для выделения и очистки ферментов, иммуноглобулинов, рецепторных белков.

Молекулы веществ (лиманды), с которыми специфически связываются определенные белки, ковалентно соединяют с частицами инертного вещества. Смесь белков вносят в колонку и искомый белок прочно присоединяется к лиганду. Остальные белки свободно выходят из колонки. Задержанный белок затем можно вымыть из колонки с помощью буферного раствора, содержащего в свободном состоянии лиганд. Этот высокочувствительный метод позволяет выделить в чистом виде очень малые количества белка из клеточного экстракта, содержащего сотни других белков.

Изоэлектрофокусирование

Используется пластина с амфолином — веществом, у которого заранее сформирован градиент pH. Проводят сначала электрофорез в горизонтальном направлении. Белки разделяются в зависимости от заряда (изоэлектрическая точка). Затем обрабатывают пластину раствором ДДС-Na и проводят электрофорез в вертикальном А. направлении. Белки разделяются в зависимости от молекулярной массы.

Анализ гомологичных белков

Гомологичные белки — белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по первичной структуре (например, локализованы в различных органах или образуются при патологических состояниях). Например, HbA (содержит Glu) HbS (содержит Val) при серповидноклеточной анемии. В

Метод пептидных карт (отпечатков пальцев), предложенный Ингремом.


Этапы:

1)оба анализируемых белка расщепляют на фрагменты (пептиды);

2)смесь пептидов каждого белка наносят в виде пятна на угол листа хроматографической бумаги;

3)проводят электрофорез в горизонтальном направлении;

4)проводят распределительную хроматографию в вертикальном направлении;

5)полученные карты окрашивают и сравнивают;

6)различающиеся пептидные пятна выделяют и анализируют.