Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, получения диагностических и вакцинных препаратов, применяют в научно-исследовательской работе. Поскольку вирусы являются абсолютными паразитами, их культивируют или на уровне организма, или на уровне живых клеток, выращиваемых вне организма в искусственных условиях. В качестве биологических моделей для культивирования используют лабораторных животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток.

Лабораторные животные (белые мыши, хлопковые крысы, кролики, хомяки, обезьяны и др.) в начальный период развития вирусологии были единственной экспериментальной биологической моделью, которую использовали для размножения и изучения свойств вирусов. На основании развития типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов животных можно судить о репродукции вирусов, то есть проводить индикацию вирусов. В настоящее время применение этой модели для диагностики ограничено из-за невосприимчивости животных ко многим вирусам человека.

Куриные эмбрионы предложены в качестве экспериментальной модели для культивирования вирусов в середине 30 -х гг. прошлого века Ф. Бернетом. К достоинствам модели относятся возможность накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша.

Интегративный тип взаимодействия (вирогения). Характеризуется встраиванием (интеграцией) нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки. При этом вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома. Интеграция вирусного генетического материала с ДНК клетки характерна для определенных групп вирусов: бактериофагов, опухолеродных (онкогенных) вирусов, некоторых инфекционных вирусов (вирус гепатита В, аденовирус, ВИЧ). Для интеграции с хромосомой клетки необходима кольцевая форма двунитчатой вирусной ДНК. У ДНК-содержащих вирусов (вирус гепатита В) их ДНК обладает свойством встраиваться в геном клетки при участии ряда ферментов. У некоторых РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, онкогенные вирусы) процесс интеграции более сложный и является обязательным в цикле их репродук ции. У этих вирусов сначала на матрице РНК с помощью вирусспецифического фермента обратной транскриптазы (ревертазы) синтезируется ДНК-копия, которая затем встраивается в ДНК клетки. ДНК вируса, находящаяся в составе хромосомы клетки, называется ДНК-провирусом. При делении клетки, сохраняющей свои нормальные функции, ДНК-провирус переходит в геном дочерних клеток, то есть состояние вирогении наследуется. ДНКпровирус несет дополнительную генетическую информацию, в результате чего клетки приобретают ряд новых свойств. Так, интеграция может явиться причиной возникновения ряда аутоиммунных и хронических заболеваний, разнообразных опухолей. Под воздействием ряда физических и химических факторов ДНК-провирус может исключаться из клеточной хромосомы и переходить в автономное состояние, что ведет к репродукции вируса.

Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип взрывной характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.

Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5 6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.). Образовавшиеся вирусы способны инициировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции.

Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически «узнавать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей. Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:

формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм;

сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодейст вии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и обра зовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно уст роенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаи модействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);

формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидко сти, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;

сложно организованные вирусы в процессе формирования вклю чают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

«Раздевание» вируса. Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.

Биосинтез компонентов вируса в клетке. Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.

Проникновение вируса в клетку. Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, то есть прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны так называемых рецепторах. Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105 . Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц. Поверхностные структуры вируса, «узнающие» специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из поверхностных белков капсида или суперкапсида. Соответствие (комплементарность) клеточных рецепторов вирусным прикрепительным белкам имеет значение для возникновения инфекционного процесса в клетке. Способность вирусов избирательно поражать определенные клетки органов и тканей организма называют тропизмом вирусов (от греч. tropos направление).

Продуктивный тип взаимодействия (репродукция вирусов). Репродукция вирусов (от англ. reproduce воспроизводить) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга:

- адсорбция вируса на клетке;

- проникновение вируса в клетку;

- «раздевание» вируса;

биосинтез вирусных компонентов в клетке;

- формирование вирусов;

- выход вирусов из клетки.

При росте на жидкой питательной среде бактерии чаще всего вызывают ее равномерное помутнение (диффузный рост), иногда выпадение осадка (придонный рост) крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), при этом бульон остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды (поверхностный рост): сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую нежную (холерный вибрион), рыхлую с отходящими вниз отростками «сталактитами» (возбудитель чумы).

Еще более разнообразен рост на плотных питательных средах. Размер, форма, консистенция, прозрачность, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде учитываются при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получения чистых культур. Колонии бывают очень мелкими (0,1 0,5 мм), мелкими (0,5 3,0 мм), средними (3-5 мм) и крупными более 5 мм в диаметре. Они могут быть круглыми (дисковидными), плоскими, иметь форму, напоминающую львиную гриву (голову медузы), ризоидными и т.п.; края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, плоская или выпуклая, а ее консистенция плотная, рыхлая, слизистая. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и различаться по другим признакам, например, у некоторых бактерий центр темный, а периферическая зона полупрозрачная.

Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является периодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5 -6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20 -40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно расту щей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др.

Затем, в силу постепенного истощения источника энергии и других жизненно важных метаболитов, скорость размножения бактерий уменьшается, наступает фаза стационарного роста, при которой количество жизнеспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культивирования. В стационарной фазе наступает период некоторого равновесия количество вновь образующихся клеток становится сопоставимым с числом погибающих клеток.

Вслед за этим наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий. Это является следствием ряда причин: истощения источников энергии и других жизненно важных метаболитов, невозможности эффективно регулировать рН среды и др., накопления продуктов метаболизма, тормозящих рост, и, возможно, каких-то других факторов.

Для количественной характеристики ростовых процессов в микробной популяции пользуются двумя показателями: абсолютная (валовая) скорость и относительная (удельная) скорость роста. Среднюю валовую скорость роста (vср) за отрезок времени (t1 -t0) можно определить по абсолютному приросту биомассы по формуле:

где m 0 и mt величины биомассы в начале и конце исследуемого отрезка времени.

Под удельной скоростью роста понимают часовой прирост, пересчитанный на единицу растущей массы:



Скорость размножения бактерий (число удвоений за единицу времени) описывают уравнением где n — число поколений.

Питательные среды. Для выращивания микроорганизмов (например бактерий) в условиях лаборатории или производства используют жидкие, плотные и полужидкие питательные среды, которые должны обязательно отвечать трем основным требованиям:

1) содержать в достаточном количестве все необходимые питательные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые факторы;

2) иметь оптимальное значение рН для роста данного вида бактерий;

3) иметь достаточную влажность (при их усыхании повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, тормозящих рост бактерий).

Среды для определения культуральных свойств бактерий должны быть по возможности прозрачными, стерильными, не содержать посторонней микрофлоры. По своему назначению их подразделяют на следующие основные категории.

Универсальные среды, на которых хорошо растут многие виды бактерий (МПБ, МП А).

Дифференциально-диагностические позволяющие отличать одни виды бактерий от других по их ферментативной активности или культуральным проявлениям (среды Эндо, Плоскирева, Гисса).